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1    - Matériel et réactifs

• Barrette vierge 2 X 8 cupules à fond plat avec support 
• Tampon d’extraction : «TE»
• Tampon de sensibilisation (Tp hydrogénocarbonate pH 9,6) : «TS»
• Ac sensibilisant anti-entérotoxine A : «AcS»
• Solution de lavage : «PBS-Tween» 
• Solution de saturation : «PBS-SAB» 
• Solution-mère étalon à 10 ng/mL d’entérotoxine A : «Sol Et»
• Echantillon provenant du surnageant d’extraction d’un aliment à tester : «S»
• Echantillon provenant du surnageant d’extraction d’un aliment non contaminé : «CQ-»
• Tampon de dilution : «PBS»
• Conjugué : Ac anti-entérotoxine A marqué à la phosphatase alcaline PAL : «Conjugué» Solution de PNPP (paranitrophénylphosphate) en tampon glycine pH 10,5 : «PNPP» 
• NaOH à 1 mol.L-1 : «NaOH».

2 - Mode opératoire

2.1 - Protocole d’extraction des entérotoxines  

• Peser 20 g d’aliment à tester et mixer.
• Ajouter 40 mL de tampon TE.
• Mélanger pour obtenir une suspension homogène.
• Laisser au repos 30 minutes pour permettre la diffusion de la toxine éventuellement présente dans l’échantillon.
• Centrifuger 15 min à 3000 g.
• Prélever le surnageant et ajuster son pH entre 7,0 et 7,5.

2.2 - Sensibilisation du support (coating)

• Introduire 200 µL de tampon TS dans le puits A1 d’une barrette 2 X 8 cupules à fond plat.
• Distribuer 200 µL d’AcS dans les autres puits : B1 à H2.
• Recouvrir la barrette avec un film autocollant. 
• Incuber 2 h à 37°C.

2.3 - Saturation (surcoating)

• Réaliser 3 lavages successifs des puits au PBS-Tween.
• Ajouter 200 µL de PBS-SAB dans chaque puits.
• Couvrir d’un film autocollant. 
• Incuber 15 min à 37°C.
• Réaliser 3 lavages successifs des puits au PBS-Tween.

2.4 – Gamme d’étalonnage et dépôts de l’Ag

• Réaliser, en tubes, une gamme de 7 concentrations décroissantes à partir de la solution étalon SolEt par dilutions successives de raison 1/2 en tampon PBS sous un volume final de 200 µL.
• Réaliser une dilution au ½ de l’échantillon S en tampon PBS.
• Déposer dans les cupules sous un volume de 100 µL selon le schéma de distribution suivant :

• Couvrir la barrette d’un film autocollant.
• Incuber 1 h à 37°C. 
• Réaliser 3 lavages successifs des puits au PBS-Tween.

2.5 - Addition du conjugué 

• Déposer 200 µL tampon PBS dans le puits C1 et 200 µL de Conjugué dans toutes les autres cupules. 
• Couvrir d’un film autocollant. 
• Incuber 20 minutes à 37°C. 
• Réaliser 3 lavages successifs des puits.

2.6    - Révélation et lecture

• Déposer, dans tous les puits, 200 µL de PNPP.
• Couvrir d’un film autocollant.
• Incuber 30 min à 37°C.
• Ajouter à tous les puits 50 µL de solution de NaOH.
• Agiter manuellement en tapotant.
• Essuyer le dessous de la barrette et lire les absorbances du contenu des puits à 405 nm contre l’air.