sciences de la vie et de la Terre

1. OBJECTIFS SCIENTIFIQUES ET PEDAGOGIQUES :

ll s'agit de démontrer que les mitochondries utilisent le pyruvate qu'elles puisent dans leur environnement cellulaire, et non le glucose, comme métabolite de base pour produire de l'ATP au cours des phénomènes respiratoire dont elles sont le siège pour produire de l' ATP.

La manipulation consiste donc à isoler des mitochondries et à les placer en présence de glucose puis en présence de pyruvate  (et non de succinate) tout en mesurant la teneur du milieu en dioxygène.

L'objectif est de faire réaliser aux élèves toutes les étapes de la manipulation allant de l'extraction à la mesure oxymétrique.

2. MATERIEL ET MONTAGE :

  - Une chaîne ExAO composée :

•  d'un réacteur avec agitateur magnétique,
•  d'une sonde oxymétrique,
•  d'une sonde température.
•  d'un logiciel dédié ou généraliste permettant la mesure de la concentration de dioxygène dans le réacteur;
•  d'une solution tampon phosphate tamponnée à pH = 7,4
•  d'une solution de pyruvate de sodium à 20% tamponnée à pH = 7,4
•  d'un mortier réfrigéré avec son pilon.

- Une solution tampon phosphate ;

Préparation pour 100 mL :

• 80 mL de solution d'hydrogénophosphate disodique (Na2HPO4) à 9,46 g.l-1 si il est anhydre (ou 23,86 g.l-1 si il est hydraté à 12 H2O)
• 20 mL de dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) à 9,06 g.L-1.
• Cette solution tampon se conserve ensuite très bien au réfrigérateur.

- Une solution tampon phosphate ;

Préparation pour 100 mL :

• 80 mL de solution d'hydrogénophosphate disodique (Na2HPO4) à 9,46 g.l-1 si il est anhydre (ou 23,86 g.l-1 si il est hydraté à 12 H2O)
• 20 mL de dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) à 9,06 g.L-1.
• Cette solution tampon se conserve ensuite très bien au réfrigérateur.

- Une solution de pyruvate :

La solution de pyruvate (CH₃CO CO₂Na) est préparée à partir de pyruvate de sodium à 98% ramené à 20% par dilution dans le tampon phosphate à pH 7,4.

- Matériel biologique : un chou fleur, le plus frais possible (un chou de bon aspect fait bien l'affaire).

3. MODE OPERATOIRE :

Durée de la mesure : 2 à 4 minutes suffisent.

- La première partie consiste à isoler les mitochondries

   L'extraction doit se faire aux environ de 4°C donc dans un mortier sortant du congélateur en présence d'une solution tampon phosphate à pH 7,4.

• Couper suffisamment de fleurs en petits morceaux dans une coupelle ;
• Les mettre dans le mortier réfrigéré et les mouiller avec 10 mL de solution tampon phosphate pH 7,4 ;
• Broyer pendant une minute sans sable pour faire éclater les cellules végétales ;
• Ajouter 20 mL de la même solution tampon ;
• Broyer à nouveau 30 secondes ;
• Filtrer au dessus d'un bécher sur 4 à 5 épaisseurs de gaze ;

On obtient ainsi une suspension (impure) de mitochondries en ayant éliminé un maximum de débris cellulaires.

- La deuxième partie consiste à faire la mesure oxymétrique de la respiration mitochondriale

• Verser 10 mL de la suspension de mitochondrie dans la cuve réactionnelle du réacteur;
• Lancer l'agitation ;
• Placer le couvercle et laisser équilibrer quelques secondes ;
• Lancer la mesure ;

  * Au temps t = 30 à 40 secondes injecter 0,2 mL de glucose 0,1 M ;

  * Au temps t = 1mn30 njecter 0,2 mL de pyruvate à 20 g.l^-1 tamponné à 7,4.

Avec mes remerciements à Anne-Marie BOUREAU, professeure de SVT au lycée Savary de Mauléon aux Sables d'Olonne pour son aide éclairée.