sciences de la vie et de la Terre

• verrerie et petits matériels (voir organisation paillasse) - pince passée à l'alcool et rincée à l'eau stérile avant chaque utilisation, gants en polyéthylène désinfectés à l'alcool à 70° avant usage...
  
• Macroéléments : milieu de Murashige et Skoog dilué 2 fois - SIGMA propose ce milieu concentré 10 fois (réf :M0654), très pratique.
• Oligoéléments : milieu de Murashige et Skoog dilué 2 fois - SIGMA propose ce milieu concentré 10 fois (réf :M0529), très pratique.
• Vitamines : hydrosol polyvitaminé Roche (en pharmacie) 0,5ml/l, il existe d'autres solutions polyvitaminées (ex: Alvityl) qui servent de compléments alimentaires pour jeunes enfants.
• Eléments organiques : saccharose 20 g/l
• Gélifiant : agar-agar 8 g/l
• Régulateurs de croissance :
  
  
  • auxine : choisir de préférence ANA (disponible chez JEULIN) qui reste très stable à la lumière et au chauffage - réaliser une solution à 1 mg par ml dans de l'alcool à 70° ( 100mg d' ANA pour 100 ml d'alcool à 70°.) -
  • cytokinine (BAP) (disponible chez JEULIN) : réaliser une solution à 1 mg par ml dans de la soude 0,1N (100 mg de BAP pour 100ml de solution de soude)
    
    

NB : les milieux qui seront fabriqués ne sont certainement pas parfaits, mais ils ont l'avantage d'être simples (et ça marche !) - toutes les manipulations se font en milieu stérile.(une hotte stérile est souhaitable mais on peut très bien travailler près d'une flamme ou d'un " bec électrique " qui semble aussi assurer une zone stérile suffisante).Informations sur coût :En considérant l'achat des produits (macroéléments + microéléments + vitamines + régulateurs de croissance) et le conditionnement imposé par le distributeur, le total s'élève à environ 110 euros.Ces produits se conservent plusieurs années au réfrigérateur ou au congélateur. Les autres produits, non spécifiques de cette manipulation, sont généralement dans les laboratoires.Avec les produits achetés, on peut facilement réalisée la manipulation dans 20 classes entières soit un coût moyen par classe de 5,5 euros.

Première étape : la production de cals.

Cette étape est réalisée au laboratoire. Manipulation en milieu stérile. Il faut compter 3 à 4 semaines pour avoir assez de cals.

Préparation du milieu de culture :

• Dissoudre le sucre dans la solution minérale, la verser dans un bécher en pyrex ou en inoxydable, ajouter l'agar-agar en pluie, attendre 3 à 4 minutes que l'agar-agar gonfle.
• Porter à ébulition à feu doux, en agitant constamment jusqu'à ce que le mélange soit homogène et limpide.
• Attendre 7 à 8 minutes que la température baisse, puis ajouter :

  -2 ml de la solution d'ANA(=2 mg par litre)
  -2 ml de la solution de BAP(=2 mg par litre)
  -0,5ml de la solution polyvitaminée

Préparation de la paillasse et mise en culture :

• éliminer la première couronne de feuilles de l'endive, prélever les feuilles sur les deux ou trois couronnes suivantes.
• les feuilles sont désinfectées 10 minutes dans un bain de Domestos dilué 5 fois.
• les feuilles sont ensuite rincées dans 3 bains successifs d'eau stérile.
• elles sont enfin déposées dans un autre bain d'eau stérile avant de prélever les explants.
  
  

• les explants sont prélevés dans la partie médiane des feuilles(15mm x 30mm).
• la polarité des tissus doit être respectée : repiquer la base de la feuille.
• utiliser un scalpel très bien affuté de façon à ne pas écraser les vaisseaux du bois.
  
  

• une température stable de 20° à 22° semble convenir, éviter les écarts trop importants
• il faut trois à quatre semaines pour avoir assez de cal.
  

• les macroéléments : identique à l'étape 1
• les oligoéléments : identique à l'étape 1
• éléments organiques : identique à l'étape 1
• vitamines : identique à l'étape 1
• gélifiant : identique à l'étape 1
• régulateurs de croissance : concentration variable suivant les milieux :
  
  

	ANA (auxine) en mg/l	BAP (cytokinine) en mg/l
Culture 1	0	0
Culture 2	0	2
Culture 3	1	2
Culture 4	2	0
Culture 5	2	2

Mise en culture des cals :

PAS de stérilisation du matériel végétal : les cals sont déjà stériles, ils sont sortis et divisés sous la hotte stérile (ou dans un environnement stérile), ils sont déposés dans des boites de pétri stériles pour attendre la mise en culture.
Cette étape peut être réalisée par les élèves si on dispose de suffisamment de cals.
La mise en culture est très délicate :

• les cals sont fragiles, ils ne doivent pas être trop sérrés avec la pince.
• les cals ne doivent pas être enfoncés profondément mais seuleument mis en contact avec le milieu.
  
  
  

• une température stable de 20° à 22° convient très bien, il faut absolument éviter les écarts trop importants
• une photopériode de 8h à 10h de lumière par jour semble satisfaisante.
• il faut un minimum de deux à trois semaines pour avoir des résultats significatifs.

 

Résultats obtenus :

	Culture 1

Culture 2

Culture 3

Culture 4

	Culture 5

Proposition d'organisation :

Organisation matérielle pour une classe :

Etapes	Nombre de tubes (24 X 150) avec milieu à prévoir
Etape1 : Production du cal	40 tubes permettent d'espérer environ 80 fragments de cal
Etape 2 : culture du cal sur différents milieux	10 pour chaque milieux = 50 tubes

	J : Lancement de la manipulation	J + 3 à 4 semaines	J + 5 à 7 semaines
Réalisation au laboratoire	1-préparation du milieu de culture pour cals 2-mise en culture des explants 3-stockage des cultures	1-préparation des différents milieux de culture 1, 2, 3, 4, 5. 2-fragmentation des cals 3-stockage des cultures une fois celles-ci réalisées
Réalisation par les élèves		1-mise en culture des cals sur les différents milieux 2-réalisation d'autres manipulations (voir les autres ateliers proposés ci-dessous)	1-observation des cultures 2-interprétation des résultats obtenus